百邁客單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（scRNA）是在單細(xì)胞水平進(jìn)行高通量基因表達(dá)譜檢測(cè)，對(duì)復(fù)雜細(xì)胞群深入分析，表征單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)譜，避免單個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)性生物學(xué)信息被大量細(xì)胞的均質(zhì)化覆蓋。

空間轉(zhuǎn)錄組（ST）是以高空間分辨率解析RNA-seq數(shù)據(jù)的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)解析單個(gè)組織切片中的所有mRNA，從而能夠定位和區(qū)分功能基因在特定組織區(qū)域內(nèi)的活躍表達(dá)信息，對(duì)于癌癥、免疫、腫瘤免疫相互作用，組織微環(huán)境，神經(jīng)和發(fā)育等領(lǐng)域，有著令人期待的應(yīng)用前景。
單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)原理對(duì)比：

 

英文題目：A single-cell and spatially resolved atlas of human breast cancers

中文題目：人類乳腺癌的單細(xì)胞和空間分辨率圖譜

發(fā)表雜志：nature genetics

影響因子：24.36

DOI：10.1038/s41588-021-00911-1

乳腺癌是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)，目前人類對(duì)它們細(xì)胞組成和組織的了解是有限的。此項(xiàng)研究中作者對(duì)人類乳腺癌進(jìn)行單細(xì)胞和空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，并開(kāi)發(fā)了一種固有亞型分類的單細(xì)胞方法來(lái)揭示復(fù)發(fā)性腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性。利用轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行免疫分型，最終提供了高分辨率的免疫圖譜和乳腺癌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的全面轉(zhuǎn)錄圖譜。

研究背景

目前對(duì)人類乳腺癌細(xì)胞異質(zhì)性和組織結(jié)構(gòu)的理解主要來(lái)源于組織學(xué)、批量測(cè)序、低維假 設(shè)研究和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)。不同的細(xì)胞亞群與腫瘤微環(huán)境(TME)中的細(xì)胞以及與疾病狀態(tài)之間的關(guān)系仍未明確。單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-scq）則為系統(tǒng)描述腫瘤的細(xì)胞景觀提供了顯著的新機(jī)會(huì)，并為揭示了細(xì)胞生物學(xué)、疾病病因?qū)W和藥物反應(yīng)提供了新見(jiàn)解。最近的研究了來(lái)自數(shù)百名患者的數(shù)百萬(wàn)細(xì)胞，以探究乳腺癌細(xì)胞類型和生態(tài)系統(tǒng)。因此，需要一個(gè)更詳細(xì)的高分子分辨率的乳腺腫瘤轉(zhuǎn)錄圖譜，進(jìn)一步界定疾病的分類，識(shí)別細(xì)胞的異質(zhì)性，從而確定細(xì)胞分類。scRNA-seq和stRNA-seq相關(guān)數(shù)據(jù)則可以更好的確定TME中的細(xì)胞是如何組織成功能單位的。

實(shí)驗(yàn)方法

材料：

(1) 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組：26個(gè)腫瘤原發(fā)灶組織，包括11個(gè)ER+、5個(gè)HER2+和10個(gè)TNBC患者

(2) 空間轉(zhuǎn)錄組：6個(gè)腫瘤原發(fā)灶組織，包括來(lái)自本研究scRNA-seq隊(duì)列的2個(gè)ER+（CID4535和CID4290）和2個(gè)TNBC（CID44971 和 CID4465），以及2個(gè)在其它實(shí)驗(yàn)室中處理的TNBC（1142243F 和 1160920F）

方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

研究結(jié)果

1. 人類乳腺癌的高分辨率細(xì)胞圖譜

為了闡明乳腺癌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，作者通過(guò)scRNA-seq分析了26個(gè)原發(fā)腫瘤，包括11個(gè)ER+， 5個(gè)HER2+和10個(gè)TNBCs。共對(duì)130246個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析注釋（圖la，b）。主要的細(xì)胞類型代表了所有腫瘤和臨床亞型（圖lc）。UMAP顯示腫瘤間質(zhì)和免疫細(xì)胞聚集在一起。在腫瘤人群中，大量大規(guī)?；蚪M重排被觀察到。這揭示了患者獨(dú)特的拷貝數(shù)變化和乳腺癌中常見(jiàn)的變化，如腔癌中chrlq增加和基底樣乳腺癌中chr5q丟失。

2. SCSubtype: scna -seq數(shù)據(jù)的固有亞型

由于無(wú)監(jiān)督聚類不能發(fā)現(xiàn)腫瘤間復(fù)發(fā)的腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)特征，作者嘗試使用建立的PAM50方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類，并開(kāi)發(fā)了一種兼容scRNA -seq的方法來(lái)進(jìn)行固有分子亞型劃分。作者使用了1100個(gè)乳腺腫瘤的癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集和大約2000個(gè)固有乳腺癌基因列表，對(duì)樣本進(jìn)行層次聚類。最終確定4組基因，這些基因?qū)⒍x單細(xì)胞衍生的分子亞型。作者將這些基因定義為 “SCSubtypc”基因標(biāo)記。

SCSubtype顯示，20個(gè)樣本中有13個(gè)樣本的腫瘤細(xì)胞低于90%屬于1個(gè)分子亞型，而只有1個(gè)腫瘤顯示完全同質(zhì)（圖2b） 。在一些管腔和HER2E腫瘤中，SCSubtype預(yù)測(cè)了少量的基底樣細(xì)胞，由免疫組學(xué)驗(yàn)證（圖2c）。其應(yīng)用進(jìn)一步證明了低細(xì)胞性小葉癌的能力，主要為L(zhǎng)umB和LumA細(xì)胞的混合物（圖2b），這與臨床IHC結(jié)果一致。

3. 復(fù)發(fā)性基因模塊驅(qū)動(dòng)腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性

接下來(lái)作者又以一種無(wú)監(jiān)督的方式研究了驅(qū)動(dòng)腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性（ITTH）的生物途徑，對(duì)至少50個(gè)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行整合聚類，生成574個(gè)ITTH基因標(biāo)記。并識(shí)別出七個(gè)群體，即“基因模塊”（GMs）?；蚣患b定出這些GMs共有的和獨(dú)特的功能特征（圖2e）。GM4在MKI67、PCNA和CDK1等基因驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞周期和增殖標(biāo)記中具有獨(dú)特的富集作用。GM3主要富集干擾素應(yīng)答、抗原呈遞和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。GM1和GM5表現(xiàn)出雌激素反應(yīng)途徑的特征，而GM1在缺氧、腫瘤壞死因子α和p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡中也表現(xiàn)出富集。
對(duì)于每個(gè)腫瘤細(xì)胞，作者計(jì)算了7個(gè)GMs的特征

（圖2e）。GM4在MKI67、PCNA和CDK1等基因驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞周期和增殖標(biāo)記中具有獨(dú)特的富集作用。GM3主要富集干擾素應(yīng)答、抗原呈遞和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。GM1和GM5表現(xiàn)出雌激素反應(yīng)途徑的特征，而GM1在缺氧、腫瘤壞死因子α和p53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡中也表現(xiàn)出富集。
對(duì)于每個(gè)腫瘤細(xì)胞，作者計(jì)算了7個(gè)GMs的特征評(píng)分，并使用層次聚類來(lái)識(shí)別細(xì)胞相關(guān)性。這清楚的將腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了分組，減少圖ld-f中所示的巨大腫瘤間變異性。一些模塊與SCSubtype相關(guān)聯(lián)，而其他模塊則顯示了更多樣化的子類型關(guān)聯(lián)（圖2f，g）。最后，作者使用基于GM的細(xì)胞狀態(tài)分配來(lái)了解腫瘤細(xì)胞的瘤內(nèi)異質(zhì)性。類似于SCSubtype（圖2b），看到了與腫瘤亞型廣泛一致但不受腫瘤亞型限制的細(xì)胞異質(zhì)性證據(jù)（圖2h）。SCSubtype和GM分析為腫瘤性ITTH的分類提供了互補(bǔ)的新方法，并進(jìn)一步證明大多數(shù)腫瘤中癌細(xì)胞表現(xiàn)出不同的表型。

4. 乳腺癌的免疫環(huán)境

高分辨率下檢查乳腺腫瘤的免疫微環(huán)境，作者重新聚集免疫細(xì)胞，以識(shí)別T細(xì)胞、固有淋巴細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、B細(xì)胞和漿細(xì)胞。通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和表位測(cè)序(CITE-seq)對(duì)4個(gè)樣本進(jìn)行免疫表型分析，并進(jìn)行基于錨點(diǎn)的整合，將蛋白表達(dá)水平轉(zhuǎn)移到其余病例中，結(jié)果顯示與實(shí)驗(yàn)測(cè)量值高度相關(guān)。

5. 淋巴細(xì)胞和先天淋巴樣細(xì)胞

作者又在患者中發(fā)現(xiàn)了18個(gè)T細(xì)胞和先天淋巴細(xì)胞簇（圖3a）。在這5個(gè)CD8集群中，由3個(gè)高表達(dá)抑制性檢查點(diǎn)分子包括 LAG3、PDCDI 和 TIGIT和2個(gè)低表達(dá) IFNG 和 TNF的CD8 + T細(xì)胞組成。另外還發(fā)現(xiàn)了由1型干擾素(IFN-I)信號(hào)和增殖驅(qū)動(dòng)的兩個(gè)簇，它們都由CD4+和CD8+ T細(xì)胞組成。通過(guò)αβ T細(xì)胞受體和NK標(biāo)記的表達(dá)，作者還鑒定了自然殺傷細(xì)胞(NK)和自然殺傷T (NKT)樣細(xì)胞。

在TNBC樣本中，IFITl/c6、LAG3/c8 和MKI67/C11的T細(xì)胞比例更高（圖3c）。值得注意的是，在TNBC中LAG3/C8消耗的CD8亞群顯著表達(dá)PD-1、LAG3、CD27和CD70配受體，可增強(qiáng)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性（圖4f）。在不同的臨床亞型中，檢查點(diǎn)分子表達(dá)的差異更為明顯，包括在非免疫細(xì)胞(如CAFs)上。這些數(shù)據(jù)提供了對(duì)每種亞型疾病最適合的免疫治療策略的見(jiàn)解。

6. 骨髓細(xì)胞

骨髓細(xì)胞形成13個(gè)簇，可在所有腫瘤中以不同頻率被識(shí)別（圖4a）。單核細(xì)胞形成三個(gè)簇，其中Mono:FCGR3A群體形成了一個(gè)小而獨(dú)特的簇，以CDI6蛋白高表達(dá)為特征（圖4b，c）。作者鑒定了表達(dá)CLEC9A或CD1C的傳統(tǒng)樹(shù)突狀細(xì)胞（cDCs），表達(dá) IRF7和 LAMP3，這在之前的乳腺癌單細(xì)胞研究中未見(jiàn)報(bào)道。巨噬細(xì)胞形成6個(gè)簇，其中一個(gè)簇具有先前“M1-like”表型相關(guān)的特征，還有兩個(gè)簇類似于“M2-like”表型，所有這些簇都與之前在乳腺癌中描述的TAMs有一些相似之處。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)了在傳統(tǒng)的M1/M2分類之外的兩個(gè)新的巨噬細(xì)胞群體（圖4a-c）。這些細(xì)胞與最近報(bào)道的脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞(LAMs)在肥胖小鼠和人類中擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄組相似性非常高。同時(shí)還觀察到HER2+腫瘤中LAMI:FABP5細(xì)胞的比例大幅降低(圖4d)， 這表明獨(dú)特的腫瘤基因組學(xué)特征或微環(huán)境調(diào)節(jié)LAM1/2的命運(yùn)。雖然RNA編碼PD-L1和PD-L2在Mac:CXCL10和DCLAMP3髓系群體中高度共表達(dá)(圖4f)，但CITE-seq 數(shù)據(jù)的分析顯示，PD-L1和 PD-L2蛋白表達(dá)在Mac:CXCL10、LAM1:FABP5、LAM2:AP0E和DC:LAMP3簇中分布更廣(圖4b和圖7g)，突出LAM1/2作為免疫調(diào)節(jié)分子的重要來(lái)源。

7. 基質(zhì)亞類類似于不同的分化狀態(tài)

在基質(zhì)室中，作者鑒定了三種主要的細(xì)胞類型(圖5a，b)。Monocle2的偽時(shí)間軌跡分析揭示了5種CAF狀態(tài)。狀態(tài)1(s1)具有高表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)和炎性樣CAFs (iCAFs)特征。當(dāng)細(xì)胞向分化狀態(tài)s4和s5過(guò)渡時(shí)，這些標(biāo)記物的表達(dá)減少，這種分化狀態(tài)通過(guò)增加ACTA2 (aSMA)、TAGLN、FAP和COL1A1的表達(dá)和富集ECM相關(guān)通路而類似于肌成纖維細(xì)胞樣CAF狀態(tài)。

對(duì)于PVL細(xì)胞，作者識(shí)別出三種狀態(tài)（圖5e）。PVL sl和s2表達(dá)與干細(xì)胞、未成熟周細(xì)胞和粘附分子相關(guān)的標(biāo)志物相關(guān)。s2的分支由RGS5、CD248和THY1確定。與基因表達(dá)一致，CITE-seq顯示PVL早期s1和s2中細(xì)胞表面CD90（THY1）和整合素分子CD49a 、CD49d的富集（圖5i，j）。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到PVL s3時(shí)，這些標(biāo)記的表達(dá)減少，而PVL s3則富含與收縮相關(guān)的基因和平滑肌表型相關(guān)的通路（圖5），揭示PVL s3細(xì)胞在IHC檢測(cè)中一直被誤分類為CAFs。

接下來(lái)，作者確定了三種內(nèi)皮狀態(tài)（圖5g）。當(dāng)細(xì)胞分成兩種狀態(tài)時(shí)，這些標(biāo)記物隨著偽時(shí)間的推移而減少，這兩種狀態(tài)都伴有內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物DLL4的表達(dá)升高（圖5h）。內(nèi)皮細(xì)胞s2以RGS5和ESM1區(qū)分，而s3表達(dá)細(xì)胞遷移和血管生成調(diào)節(jié)因子。由于血管的生成是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，涉及內(nèi)皮柄細(xì)胞和頂端細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)換。在臨床亞型和三個(gè)正常乳腺組織樣本中鑒定出相似的CAF、PVL和內(nèi)皮細(xì)胞狀態(tài)，表明它們可能是在TME中經(jīng)歷重構(gòu)的固有細(xì)胞類型。

8. 對(duì)乳腺癌異質(zhì)性進(jìn)行空間映射

為了深入了解組織細(xì)胞類型，作者對(duì)6個(gè)樣本進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析（圖6a），同時(shí)作者還將其與scRNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了匹配分析（圖6b）。在6個(gè)病例中，通過(guò)立體鏡和病理學(xué)識(shí)別出癌細(xì)胞的位置，然后檢查每個(gè)位置的7個(gè)GM標(biāo)記，這揭示了在TNBC病例中 GM3和GM4的預(yù)期富集以及在ER +病例中GM1和GM5的預(yù)期富集。這揭示了兩個(gè)主要的星系團(tuán)GM1、GM3、GM5和GM6和另一個(gè)星系團(tuán)的GM2和GM4在6個(gè)病例中大多是保守的（圖 6d）。有趣的是，GM3和GM4在所有樣本中顯示出強(qiáng)烈的負(fù)相關(guān)（圖6e-g），表明這些不同的癌癥表型發(fā)生在乳腺癌相互排斥的區(qū)域。

9. 繪制新的異型細(xì)胞相互作用

雖然一些研究表明間充質(zhì)細(xì)胞在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用，但基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的相互作用尚未在組織中被闡明。作者在6例病患中發(fā)現(xiàn)5例肌成纖維細(xì)胞樣CAFs和iCAFs 之間存在中度負(fù)相關(guān)性（圖7a-c）。CAF定位在7個(gè)HER2+乳腺腫瘤的獨(dú)立空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是一致的，表明這種關(guān)系在不同的臨床亞型中是保守的（圖7a）。與上述iCAFs的免疫調(diào)節(jié)特性一致的是，在兩項(xiàng)研究中，iCAFs均與多個(gè)淋巴細(xì)胞群體共定位（圖7a,d，c）。在6個(gè)樣本中，肌成纖維細(xì)胞樣CAFs與CD8+T細(xì)胞相關(guān)（圖7a），揭示與高TIL浸潤(rùn)或免疫炎癥表型的浸潤(rùn)性乳腺癌的功能相關(guān)。通過(guò)整合信號(hào)預(yù)測(cè)和細(xì)胞鄰近性，這些數(shù)據(jù)突出了 CAFs直接調(diào)控免疫細(xì)胞的相關(guān)候選因子。

之前，作者定義了巨噬細(xì)胞狀態(tài)LAM1，LAM2和Mac:CXCL10/c9，它們是具有高表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)分子。在所有的局部Visium病例中，LAM1和LAM2細(xì)胞均存在于浸潤(rùn)性腫瘤區(qū)域；然而，LAM2也存在于高基質(zhì)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的形態(tài)學(xué)區(qū)域。在所有三個(gè)亞型的8個(gè)腫瘤中，LAM2細(xì)胞與CD4+和CD8 + T細(xì)胞正相關(guān)（圖7a）。多個(gè)腫瘤的LAM2細(xì)胞和CD4+/CD8+T細(xì)胞富集的spots共同表達(dá)PD-L1/PD-1和PD-L2/PD-1，表明這些細(xì)胞可能具有免疫調(diào)節(jié)的功能相關(guān)性。

10. 乳腺腫瘤生態(tài)型與患者生存相關(guān)

作者在26個(gè)腫瘤中觀察到顯著的變異和細(xì)胞頻率的重復(fù)模式，并從單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中估計(jì)細(xì)胞組分，發(fā)現(xiàn)捕獲的細(xì)胞組分和預(yù)測(cè)的比例之間具有良好的整體相關(guān)性，大多數(shù)細(xì)胞類型出先顯著相關(guān)性。作者還觀察到在匹配bulk-PAM50分類的腫瘤中，聚類顯示9個(gè)細(xì)胞組成相似的腫瘤簇（“生態(tài)型”）（圖8a-c）。這些生態(tài)型與腫瘤亞型、sc亞型細(xì)胞和主要細(xì)胞類型的多樣性相關(guān)（圖8a）。Ecotype 3（E3）在含有Basal_SC等細(xì)胞和基底樣PAM50亞型的腫瘤中富集（圖8a，b）。El、E5、E6、E8和E9主要由管腔細(xì)胞組成。E4對(duì)與抗腫瘤免疫相關(guān)的免疫細(xì)胞高度富集（圖8a）。E2 主要由 LumA 和正常樣腫瘤組成（圖8a,b）。

在預(yù)后方面，E2腫瘤患者預(yù)后較好（圖8d，e）， E3腫瘤患者5年生存率較差（圖8d）， 這與已知的基底樣和高增殖腫瘤的不良預(yù)后相一致。E7預(yù)后也較差，以HER2E腫瘤為主；E4 也有相當(dāng)大的比例HER2E和基底樣腫瘤（圖8b），但這些患者的預(yù)后明顯好于E7，可能是抗腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的結(jié)果。通過(guò)對(duì)整合基因組群與生態(tài)型之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)E3中來(lái)自整合基因組群10的癌癥比例很高，5年生存率同樣很低。E7有很高比例的ERBB2擴(kuò)增和HER2E整合基因組簇5。然而大多數(shù)生態(tài)型與特定的整合基因組簇或PAM50亞型沒(méi)有明確的關(guān)聯(lián)，這反映了基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞在生態(tài)型中的作用。

小結(jié)

在此項(xiàng)研究中，作者主要將乳腺腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)分為三個(gè)層次。首先，詳細(xì)的細(xì)胞分類，包括新的細(xì)胞類型和狀態(tài)，以及表征細(xì)胞異質(zhì)性的新方法。第二，腫瘤內(nèi)細(xì)胞位置和相互作用的空間圖譜，揭示組織內(nèi)腫瘤和宿主細(xì)胞表型的協(xié)調(diào)性及細(xì)胞之間的空間關(guān)系。第三，利用反褶積，作者還觀察了具有相似細(xì)胞類型比例和預(yù)后相關(guān)性的腫瘤組，稱為生態(tài)型，通常由特定的共分離細(xì)胞群驅(qū)動(dòng)。未來(lái)的工作將研究組織結(jié)構(gòu)和腫瘤生態(tài)型的分子機(jī)制，旨在解釋它們?cè)谂R床結(jié)果上的差異，并研究腫瘤生態(tài)型是否可以用于個(gè)體化治療。