研究背景

陰莖勃起是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，整個過程需要神經(jīng)、內(nèi)分泌、血管和陰莖海綿體組織精密調(diào)節(jié)、協(xié)調(diào)完成。海綿體損傷可引起多種疾病，包括影響了5%~22%男性的陰莖勃起功能障礙（ED）。

ED不僅影響患者身心健康以及家庭和諧，還可能是心血管疾病的先兆。雖然目前已經(jīng)知道在勃起發(fā)生和維持中不同功能區(qū)域的作用，但以往研究大多都依賴于解剖觀察、影像學(xué)檢查，以及少數(shù)基因或蛋白質(zhì)的表達模式分析，缺乏全面的分子水平分析。

此外，多數(shù)ED相關(guān)研究是基于大鼠模型的，但當(dāng)前對于大鼠和人類間陰莖海綿體（CC）的解剖學(xué)和信號網(wǎng)絡(luò)差異認識尚不清晰。因此，為了更好的使用大鼠模型開展研究，有必要深入研究大鼠陰莖海綿體的結(jié)構(gòu)/功能調(diào)控與人類的異同。

材料方法

研究材料：4例陰莖癌患者，3例健康志愿者，10例DMED（糖尿病性勃起功能障礙）患者；4只健康大鼠，6只DMED大鼠模型。

研究方法：Masson/H&E染色（n=7），scRNA-seq（n=12，3例健康人類CC/3例DMED人類CC，3例健康大鼠CC/3例DMED大鼠CC），空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（BMKS1000，n=3，1例陰莖腫瘤患者、1例勃起功能正常雄性大鼠以及1例DMED模型大鼠）等。

驗證實驗：包括油紅O/尼羅紅/菲律賓鏈霉菌染色、不同硬度ECM條件下培養(yǎng)的FB細胞形態(tài)信息及bulk RNA-seq數(shù)據(jù)、免疫熒光、超聲彈性成像。

研究結(jié)果

1.人類和大鼠CC細胞和空間特征

通過scRNA-seq數(shù)據(jù)，研究者在人類CC（陰莖海綿體）中鑒定出7種類型細胞，僅在大鼠CC中發(fā)現(xiàn)一小部分中性粒細胞和B細胞。使用scRNA-seq數(shù)據(jù)對空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行注釋（CellTrek），研究者得到了人類和大鼠CC樣本空間細胞分布圖譜（level3，20μm分辨度），發(fā)現(xiàn)雖然人類和大鼠CC中的細胞類型相似，但每種類型細胞比例、空間分布特征存在異質(zhì)性。

圖1-通過scRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)得到的人類，以及正常/DMED條件下大鼠的CC細胞全局表達譜

2.人類和大鼠CC組織中的空間異質(zhì)性

作為一種特殊的血管竇結(jié)構(gòu)，當(dāng)前已初步認識到CC上不同區(qū)域的類型不同。得益于空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，研究者發(fā)現(xiàn)人類CC組織中SVG（空間差異基因）top（如CCL18、PLA2G2A、C3）主要在不同類型細胞中表達，但有一些表現(xiàn)出空間分布特異性的基因并沒有在scRNA-seq數(shù)據(jù)中表現(xiàn)出細胞類型特異性；人類CC組織3個代表性區(qū)域中，不同區(qū)域的細胞比例不同，如區(qū)域I（海綿體動脈區(qū)域）EC（內(nèi)皮細胞）占比更高，而區(qū)域III（白膜附近區(qū)域）包含更少的FB（成纖維細胞）但SMC（平滑肌細胞）豐富。大鼠CC組織也表現(xiàn)出相似的情況（大鼠CC中缺乏梳狀中隔和明顯的海綿體動脈，研究者根據(jù)人類CC代表性區(qū)域的空間位置，在大鼠CC中也劃分出可比較的3個代表性區(qū)域）。

圖2-人類CC組織的轉(zhuǎn)錄特征和空間異質(zhì)性

3.根據(jù)scRNA-seq數(shù)據(jù)比較人類和大鼠CC中的細胞類型

多數(shù)勃起調(diào)控研究是基于大鼠模型的。為了理解大鼠和人類間CC微環(huán)境的異同，研究者通過分析scRNA-seq數(shù)據(jù)中的人—大鼠同源基因，發(fā)現(xiàn)雖然人類和大鼠物種不同，但CC中相同類型細胞仍可以聚成同一簇，進一步分析發(fā)現(xiàn)人類和大鼠CC中相同類型細胞的轉(zhuǎn)錄相似性>70%且正相關(guān)，表明在多數(shù)情況下，使用大鼠模型模擬、研究人類CC微環(huán)境的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是可接受的。然而，人類和大鼠CC中相同類型細胞的DEGs（差異表達基因）top并不一致，提示當(dāng)研究者更關(guān)注一個或幾個基因或通路時，使用大鼠模型要特別注意。

附錄圖7-scRNA-seq數(shù)據(jù)評估得到的大鼠和人類CC間相似性和差異性

4.比較人類和大鼠CC空間轉(zhuǎn)錄組全局

通過分析空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的人—鼠同源基因，研究者找到人類和大鼠共有的459個top SVG，大多數(shù)SVG并不是細胞類型特異的，其中EC、FB和SMC是表達這些SVG最多的3種類型細胞。富集分析結(jié)果顯示，基礎(chǔ)生物學(xué)過程如“translational initiation”、“extracellular structure organization”以及“protein targeting”，在人類和大鼠CC組織的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中是保守的；人類特異SVG主要與炎癥響應(yīng)有關(guān)，而這些SVG的大鼠同源基因主要與代謝過程有關(guān)。

圖3-比較大鼠和人類CC微環(huán)境中的空間差異基因和信號通路

5.人類和大鼠CC微環(huán)境中的細胞—細胞互作分析

為了研究、比較人類和大鼠間CC微環(huán)境的復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)，研究者使用scRNA-seq數(shù)據(jù)進行CellChat分析，發(fā)現(xiàn)大鼠CC中的細胞互作數(shù)量雖然小于人類，但細胞互作強度是相似的。基于這些互作的表達模式，研究者進行簡單的分類，發(fā)現(xiàn)雖然胞外基質(zhì)相關(guān)的互作整體強度與細胞類型間配體-受體強度相當(dāng)，但兩者基因組成是有差異的；血管生成相關(guān)的互作整體強度在人類和大鼠中沒有差異，但基因組成存在差異，如大鼠CC微環(huán)境中是主要是VEGFB表達，而人類CC微環(huán)境中高表達的是VEGFA和IGF1。

空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，VEGF配體主要集中富集在人類CC中的海綿體動脈（區(qū)域I）附近，而在蛋白質(zhì)水平，VEGFA和IGF1并不共定位。大鼠中VEGF和IGF基因的空間分布模式與人類的相似，但蛋白質(zhì)水平上區(qū)域I中存在高濃度的VEGFA和IGF1。此外，免疫相關(guān)的互作在人類CC與大鼠CC中表現(xiàn)出相似或者更高的整體信息流，但一些配體亞型在大鼠中高表達。

這些scRNA-seq數(shù)據(jù)的分析結(jié)果與基于空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)SVG的富集分析結(jié)果高度一致。

圖4-配體-受體對分析顯示人類和大鼠CC組織中的細胞—細胞通訊

6.EC表現(xiàn)出顯著的空間異質(zhì)性和物種差異

根據(jù)以往的解剖觀察以及scRNA-seq數(shù)據(jù)分析，可知CC中包含3種類型EC（內(nèi)皮細胞），包括GJA5+ EC（動脈內(nèi)皮細胞）、SELP+ EC（靜脈內(nèi)皮細胞）以及KIT+ EC（海綿體竇內(nèi)皮細胞）。人類CC中GJA5+ EC占比最低，主要分布在海綿體動脈區(qū)域；SELP+ EC主要分布在白膜區(qū)域；KIT+ EC廣泛分布。但大鼠CC中，Selp+ EC比例更高，Gja5和Kit可能并不是有用的靜脈和CC內(nèi)皮細胞標(biāo)志物?；趕cRNA-seq數(shù)據(jù)進行GO分析，研究者發(fā)現(xiàn)不同類型EC富集了不同功能，多數(shù)細胞類型特異性的term（條目）在人類CC中并沒有空間分布異質(zhì)性，但一些特殊term在大鼠CC中表現(xiàn)出空間分布異質(zhì)性。

附錄圖10-人類和大鼠EC簇間的物種相似性和異質(zhì)性

7.SMC表現(xiàn)出顯著的空間異質(zhì)性和物種差異

根據(jù)以往研究結(jié)果，研究者將CC中的SMC（平滑肌細胞）簇分為VSMC（血管平滑肌細胞）和CCSMC（海綿體小梁平滑肌細胞）。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，兩種類型SMC在物種間存在顯著差異，其中人類CCSMC高表達DES，VSMC高表達RGS5；大鼠CCMS和VSMC可通過Igfbp2和Rgs5區(qū)分；蛋白質(zhì)水平上，CCSMC與VSMC不同，后者不表達肌動蛋白或肌球蛋白；根據(jù)SMC的SVG空間分布模式，發(fā)現(xiàn)ACTC1/Actc1只在人類CCSMC中表達；前期研究發(fā)現(xiàn)ADRA2A在人VSMC表達，ADRA2C在人CCSMC中表達，空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也驗證了這一發(fā)現(xiàn)，但大鼠CC中Adra2a并沒有表現(xiàn)出細胞類型特異性而Adra2c的表達未檢測到，提示在這個方面大鼠并不是合適的研究模型。

圖5-人類和大鼠SMC簇間的物種相似性和異質(zhì)性

8.人類和大鼠FB有相似的聚類特征和空間分布，但亞型比例不同

近期，CC的FB（成纖維細胞）成為研究熱點，但對其空間和物種異質(zhì)性仍不清楚。研究者根據(jù)PI16、APOE及其他載脂蛋白、COMP的表達情況，將人類CC FB分成3種亞群。空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，人類CC中3種FB亞群空間分布模式不同，富集的功能也不同；大鼠CC FB表現(xiàn)出與人類CC FB相似的亞群和標(biāo)志基因，但每種亞群的比例與人類顯著不同。

APOE與脂滴轉(zhuǎn)運密切相關(guān)。油紅O染色顯示大鼠CC中脂滴位置與Apo+ FB的空間分布高度一致，且都在白膜下富集；免疫熒光染色結(jié)果顯示大多數(shù)脂滴與APOE蛋白共區(qū)域化出現(xiàn)且在白膜下有更高的富集，特別是在區(qū)域III（左右CC連接區(qū)域）；人類CC中APOE分布特征與大鼠類似但表達更廣泛。

前期研究成果顯示，F(xiàn)B是人類CC中最強的外向信號源，在調(diào)控微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起到重要作用。因而，F(xiàn)B表型轉(zhuǎn)變可能與CC結(jié)構(gòu)和功能變化密切相關(guān)。通路活性分析顯示PI3K通路活性分值與APO+ FB有相似的空間分布模式，而TNF-α和TGF-β的空間分布模式與之相反；空間上CCSMC與FB相距較遠（level13，100μm分辨度分析FB生態(tài)位），而GJA5+ EC、VSMC、SWC（Schwann細胞）和T細胞與COMP+ FB空間距離較近，表明COMP+ FB與神經(jīng)和血管密切相關(guān)；CXCLs、CCN2以及C3與3種FB亞群生態(tài)位正相關(guān)，但CCN5和C7與COMP+ FB生態(tài)位負相關(guān)，GREM1不與PI16+ FB或APO+ FB相關(guān)但與COMP+ FB生態(tài)位顯著正相關(guān)。

圖6-CC中不同成纖維細胞亞群表現(xiàn)出不同的空間分布特征

9.CC中機械力信號存在空間異質(zhì)性，并調(diào)控FB表型轉(zhuǎn)變

以往研究表明病理條件下YAP信號誘導(dǎo)FB-肌成纖維細胞表型轉(zhuǎn)變，但這不能完全解釋生理條件下存在著的多種FB亞型，特別是有高脂質(zhì)代謝活性的APO+ FB。有報道ECM（胞外基質(zhì)）機械力調(diào)控多種細胞類型的脂質(zhì)代謝。

本研究中，研究者發(fā)現(xiàn)COMP+ FB生態(tài)位顯著富集了“integrin-mediated signaling pathway”和“response to mechanical stimulus”term；人和大鼠CC中ECM/細胞組成比例表現(xiàn)出明顯的空間異質(zhì)性；空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和免疫熒光染色結(jié)果類似，靠近陰莖背神經(jīng)血管束的上極區(qū)域顯示出較低的纖維化水平，而遠離背神經(jīng)血管束的顯示出較高的纖維化水平；空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和超聲彈性成像結(jié)果都表明，APO+ FB與更柔軟的組織硬度有關(guān)，而COMP+ FB與更硬的組織有關(guān)；不同胞外基質(zhì)硬度培養(yǎng)下的CC FB形態(tài)不同，bulk RNA-seq數(shù)據(jù)顯示機械應(yīng)激顯著改變了FB的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，一些參與調(diào)控脂質(zhì)代謝的基因與低機械力信號有關(guān)；scRNA-seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示APO+ FB分值隨組織硬度增加而降低，COMP+ FB分值隨組織硬度增加而增加；染色結(jié)果顯示隨著組織硬度增加，F(xiàn)B中的中性脂質(zhì)和膽固醇累積降低。

綜上，這些結(jié)果表明機械力信號直接參與調(diào)控FB的表型轉(zhuǎn)變。

圖7-局部機械力信號強度決定了這個區(qū)域內(nèi)成纖維細胞的表型

10.人類和大鼠CC經(jīng)歷了相似的DMED病理變化

為了更好的認識DMED病理條件下，人類和大鼠CC微環(huán)境發(fā)生的變化是否與每種CC細胞類型中發(fā)生的分子水平變化相一致，研究者通過分析scRNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)DMED大鼠模型和DMED患者都經(jīng)歷了顯著的纖維化以及細胞組分丟失，但兩者間的轉(zhuǎn)錄組差異顯著。富集分析結(jié)果顯示，僅DMED大鼠模型富集了“extracellular structure organization”；“actin cytoskeleton or organization”和“oxidative phosphorylation”僅在人類DMED患者SMC中發(fā)現(xiàn)，“regulation of MARK cascade”僅在DMED大鼠模型SMC中富集；“rhythmic process”僅在人類DMED患者FB中富集，“l(fā)eukocyte activation”僅在DMED大鼠模型FB中富集。

空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示DMED大鼠模型陰莖中，除尿道以外的組織區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達水平整體降低，而scRNA-seq數(shù)據(jù)顯示DMED狀態(tài)細胞的轉(zhuǎn)錄水平高于正常狀態(tài)的細胞，這或許意味著，可能是由于單位面積上細胞數(shù)量降低，導(dǎo)致空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平降低的現(xiàn)象。

附錄圖13-通過scRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組評估DMED條件下CC的病理變化

研究總結(jié)

本文繪制了人類和大鼠陰莖海綿體（CC）的生理、病理條件下的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜，結(jié)合多組學(xué)數(shù)據(jù)，系統(tǒng)比較了兩個物種間的異同。本研究成果為人類、大鼠陰莖海綿體的分子解剖學(xué)，以及跨細胞類型和區(qū)域的信號網(wǎng)絡(luò)提供了清晰洞見。同時在分子水平比較了人類和大鼠的陰莖海綿體異同，為理解動物模型的可用性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，推動臨床前實驗和臨床轉(zhuǎn)化更高效、可靠。文中還闡述了CC中機械力信號的空間分布異質(zhì)性，并確認ECM機械信號可以調(diào)節(jié)FB表型轉(zhuǎn)變，提出靶向APO+ FB或可成為未來治療DMED的有效手段。最后，研究者也明確指出了本文中研究的局限性，為后續(xù)研究指明了方向。

參考文獻：

Yin et al, Molecular and spatial signatures of human and rat corpus cavernosum physiopathological processes at single-cell resolution. Cell Rep. 2024 Sep 24;43(9):114760. doi: 10.1016/j.celrep.2024.114760. Epub 2024 Sep 18.