研究單位：西安交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院院長張保軍教授團隊

期刊名：cellular & molecular immunology

影響因子：21.8

樣本類型：8-12周齡小鼠

文章采用技術(shù)：空間轉(zhuǎn)錄組測序、單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）

引言

在對抗感染和腫瘤的免疫戰(zhàn)場上，記憶?CD8+?T?細(xì)胞是守護機體的「長效衛(wèi)士」，?它們能快速識別再次入侵的病原體或癌細(xì)胞，發(fā)動強力攻擊。長久以來，樹突狀細(xì)胞（DC）被認(rèn)為是主導(dǎo)記憶?T?細(xì)胞分化的核心「指揮官」。研究人員通過整合單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）和空間轉(zhuǎn)錄（BMKMANU?S1000）技術(shù)，揭示了單核細(xì)胞才是調(diào)控記憶?CD8+?T?細(xì)胞分化的關(guān)鍵「操盤手」，其奧秘藏在「細(xì)胞接觸」與「分子信號」的雙重機制中。其中BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)平臺大放異彩，成為揭CCR2+單核細(xì)胞促進記憶CD8+?T細(xì)胞分化的關(guān)鍵工具。

研究背景

CD8+?T細(xì)胞在適應(yīng)性免疫中扮演著關(guān)鍵角色，能夠保護機體免受病原體感染和消除惡性細(xì)胞。當(dāng)CD8+?T細(xì)胞識別到抗原后，會迅速增殖并分化為效應(yīng)CD8+?T細(xì)胞和記憶CD8+?T細(xì)胞。效應(yīng)CD8+?T細(xì)胞負(fù)責(zé)即時清除感染，而記憶CD8+?T細(xì)胞則提供長期保護，能夠在再次遇到相同抗原時迅速啟動免疫反應(yīng)。然而，單核細(xì)胞（monocytes）作為重要的髓系免疫細(xì)胞，雖在炎癥遷移中作用明確，但其是否直接參與T細(xì)胞分化尚無定論。

研究策略

動物模型與樣本制備

實驗動物：優(yōu)先選擇8-12周齡的CD45.1+/CD45.2+及OT-I轉(zhuǎn)基因小鼠

樣本制備：脾臟單細(xì)胞懸液通過機械分離和紅細(xì)胞裂解（ACK緩沖液）制備

技術(shù)手段

• 流式細(xì)胞術(shù)分析

細(xì)胞分選：從感染LM-WT的小鼠脾臟中分選出cDCs、moDCs和單核細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞（APCs）

細(xì)胞刺激與培養(yǎng)：將分選出的APCs與OVA肽段體外共孵育后，過繼轉(zhuǎn)移到已接受初始OT-I+?CD8+?T細(xì)胞的WT受體小鼠體內(nèi)，或與體外刺激的初始CD8+?T細(xì)胞共培養(yǎng)

表型檢測：通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CD8+?T細(xì)胞的分化表型，包括記憶相關(guān)標(biāo)記物（如cKit、Sca1、Bcl6、TCF1和Eomes）的表達

• 空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)

樣本處理：對感染第0天和第5天的小鼠脾臟組織進行切片，并進行H&E染色以確定組織形態(tài)學(xué)特征

空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析：利用BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對脾臟切片進行分析，揭示不同免疫細(xì)胞亞群在脾臟中的空間分布

數(shù)據(jù)整合：將scRNA-seq數(shù)據(jù)與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進行整合，通過Seurat等工具的FindTransferAnchors和TransferData函數(shù)，將scRNA-seq中識別的細(xì)胞類型映射到空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)中，實現(xiàn)細(xì)胞類型的空間定位

• 免疫熒光染色

樣本處理：對感染第0天和第5天的小鼠脾臟組織進行切片，并進行免疫熒光染色

抗體選擇：使用特異性抗體標(biāo)記CD8+?T細(xì)胞、單核細(xì)胞（CCR2+）、樹突狀細(xì)胞（CD11c+）等關(guān)鍵細(xì)胞類型

結(jié)果分析：通過顯微鏡觀察并拍攝染色切片，分析不同細(xì)胞類型在脾臟中的共定位關(guān)系

• 生物信息學(xué)分析

差異基因分析：利用Wilcoxon秩和檢驗等統(tǒng)計方法，識別不同細(xì)胞亞群間的差異表達基因

通路富集分析：通過ClusterProfiler等工具對差異表達基因進行通路富集分析，揭示潛在的生物學(xué)過程

偽時間分析：利用Monocle3等工具構(gòu)建細(xì)胞分化軌跡的偽時間軸，分析CD8+?T細(xì)胞亞群在分化過程中的基因表達變化

研究結(jié)果

研究結(jié)果一：通過空間分辨轉(zhuǎn)錄組學(xué)繪制急性感染后脾組織的圖譜

為了研究免疫反應(yīng)過程中不同免疫細(xì)胞的空間分布和CD8+?T細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)機制，研究人員通過整合單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）和BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)，分析了急性感染模型中脾臟免疫細(xì)胞的空間分布與CD8??T細(xì)胞分化機制。實驗采用OT-I轉(zhuǎn)基因小鼠模型，通過李斯特菌（LM-OVA）感染誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，關(guān)鍵發(fā)現(xiàn)包括：1）脾臟形成7個功能集群（B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞等）；2）感染后T/B細(xì)胞區(qū)擴大，APCs（B細(xì)胞、DC、巨噬細(xì)胞）在T細(xì)胞區(qū)外圍聚集；3）空間重組與T細(xì)胞分化（MP/TE亞群）顯著相關(guān)。多組學(xué)整合揭示了免疫微環(huán)境的動態(tài)調(diào)控機制，為理解感染中細(xì)胞互作提供了多組學(xué)視角。

研究結(jié)果二：急性感染期間效應(yīng)和memoryCD8?T細(xì)胞分化軌跡不同

為了探索CD8+?T細(xì)胞分化的空間決定因素，特別是與近端細(xì)胞的相互作用，對于急性感染模型研究人員進行了亞群分析、分化路徑分析和功能驗證，結(jié)果表明在急性感染中，IFN反應(yīng)型CD8+?T細(xì)胞和CD8+MP?細(xì)胞之間分化軌跡的不同意味著，效應(yīng)和記憶CD8+?T細(xì)胞的命運決定于免疫反應(yīng)的初始階段，而IFN應(yīng)答和MP?CD8+?T細(xì)胞分別是效應(yīng)和記憶CD8+?T細(xì)胞分化途徑的初始階段。

研究結(jié)果三：跨組織區(qū)域細(xì)胞亞群的鑒定和空間圖譜

為了研究脾臟免疫細(xì)胞在感染前后的動態(tài)變化，研究人員通過整合單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）和BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)，進一步鑒定了供體和受體脾臟中的免疫細(xì)胞群。結(jié)果顯示：①細(xì)胞組成：從1.6萬細(xì)胞中鑒定出19類，包括CD8??T細(xì)胞亞群（如記憶前體和IFN反應(yīng)性細(xì)胞）及髓系細(xì)胞。②動態(tài)變化：感染后第5天，T細(xì)胞區(qū)從以初始CD8+?T細(xì)胞為主轉(zhuǎn)為記憶前體和效應(yīng)細(xì)胞主導(dǎo)，且單核細(xì)胞取代DC成為主要浸潤的髓系細(xì)胞。③功能提示：不同的APC和CD8+?T細(xì)胞之間的相互作用在免疫反應(yīng)和CD8+?T細(xì)胞的分化中起著重要作用。

研究結(jié)果四：單核細(xì)胞和CD8+?MP細(xì)胞的抗原依賴性共定位

為了探索不同細(xì)胞類型之間潛在的細(xì)胞相互作用，研究人員通過評估特異性免疫細(xì)胞標(biāo)記物的表達、免疫熒光染色及空間轉(zhuǎn)錄組分析，檢查了第0天和第5天脾臟中CD8+?T細(xì)胞和單核細(xì)胞的空間分布。結(jié)果顯示單核細(xì)胞和CD8+?MP細(xì)胞以抗原刺激依賴性的方式在空間上共定位，表明單核細(xì)胞可能對CD8+?MP細(xì)胞的分化有關(guān)鍵影響。

研究總結(jié)

CD8+T?細(xì)胞是適應(yīng)性免疫的重要執(zhí)行者；特別是記憶CD8+?T細(xì)胞對強效和長期保護至關(guān)重要。CD8+?T細(xì)胞分化在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控機制已被廣泛研究。然而，人們對感染過程中效應(yīng)和記憶CD8+?T細(xì)胞分化的空間要求仍然知之甚少。研究人員通過整合BMKMANU?S1000空間轉(zhuǎn)錄組（ST）技術(shù)和scRNA-seq技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了記憶CD8+?T細(xì)胞分化的新機制，該機制涉及單核細(xì)胞和CD8+?MP細(xì)胞之間的解剖學(xué)鄰近性和TGF-β信號傳導(dǎo)。該研究結(jié)果闡述了記憶CD8+?T細(xì)胞命運決定的新機制，并強調(diào)單核細(xì)胞作為關(guān)鍵的APC群體，通過細(xì)胞間接觸依賴的方式在感染過程中促進記憶CD8+?T細(xì)胞的分化。

1.1 適用范圍

本指南介紹百邁客實驗平臺空間轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)品的送樣要求及制備方法，采集送樣前請詳細(xì)閱讀。

1.2 聲明

我國法定的傳染病分為三大類：甲類（一類）傳染病包括霍亂和鼠疫；乙類（二類）傳染病包括傳染性非典肺炎、新型冠狀病毒 (2019-nCoV)肺炎、艾滋病、病毒性肝炎、人感染高致病性禽流感、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、流行性出血熱、狂犬病、登革熱、流行性乙型肝炎、細(xì)菌性和阿米巴性痢疾、肺結(jié)核、傷寒和副傷寒、炭疽、流行性腦脊髓膜炎、白喉、百日咳、新生兒破傷風(fēng)、猩紅熱、布魯士病、梅毒、淋病、鉤端螺旋體病、血吸蟲、瘧疾。丙類（三類）傳染病包括流行性感冒、流行性腮腺炎、流行性和地方性斑疹、傷寒、風(fēng)疹、麻風(fēng)病、急性出血性結(jié)膜炎、黑熱病、絲蟲病、包蟲病、還有除了霍亂、細(xì)菌、阿米巴性痢疾、傷寒和副傷寒以外的感染性腹瀉。

涉及上述傳染病的科學(xué)研究需符合國家的相關(guān)規(guī)定，為嚴(yán)格遵守國家法律法規(guī)，本著對社會及相關(guān)操作人員負(fù)責(zé)的態(tài)度，我司要求客戶方真實準(zhǔn)確地提供樣品的生物安全性信息，對樣品是否含有上述感染性病原體進行事先說明。樣品中含有上述感染性病原體時，客戶方需要提供符合生物安全等級要求的實驗室以便開展相關(guān)實驗，實驗進行時，客戶方有義務(wù)協(xié)助我方實驗員做好實驗安全防護。客戶方不得隱瞞樣品的生物安全性信息，若出現(xiàn)樣品含有感染性病原體而客戶事先未告知我司的情況，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)我司將停止進行相關(guān)項目，已產(chǎn)生的費用由客戶方承擔(dān)。如因客戶方提供的生物安全性信息不實、隱瞞樣品感染性等有關(guān)情況等造成實驗員及相關(guān)人員被感染、疾病傳播等嚴(yán)重后果的，我司將按規(guī)定報告國家相關(guān)部門，并將通過法律等手段追究相關(guān)責(zé)任。

2、項目流程

目前百邁客空間轉(zhuǎn)錄組測序服務(wù)模式默認(rèn)為組織寄送模式，如果有特殊情況需要上門服務(wù)，請與百邁客技術(shù)人員確認(rèn)實驗室儀器設(shè)備情況。

組織寄送前請至少提前1周進行預(yù)約，百邁客接收到樣本并確認(rèn)樣本無異常后，3-5天內(nèi)安排RNA質(zhì)檢并反饋質(zhì)檢結(jié)果，質(zhì)檢合格后安排切片、組織結(jié)構(gòu)確認(rèn)與透化。

圖 1 百邁客新鮮冷凍樣本空間轉(zhuǎn)錄組服務(wù)流程

3、新鮮冷凍樣本

3.1 樣本要求

10x空間轉(zhuǎn)錄組每塊組織樣本長寬不宜超過6.5*6.5mm，百創(chuàng)S3000空間轉(zhuǎn)錄組每塊組織樣本長寬不宜超過6.8*6.8mm，厚度＞1.5mm，S2000A空間轉(zhuǎn)錄組每塊組織樣本長寬不宜超過11*11mm，組織截面覆蓋小于25%的組織，建議多個包埋成一個OCT包埋塊，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個組織保持在一個水平面充分利用捕獲區(qū)域。

注1：在樣本量足夠的情況下，每個動物樣本最好準(zhǔn)備至少2個包埋塊，1份用于RNA質(zhì)檢（切片質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)見第3部分）、切片選片、上透化芯片和表達芯片，另1份用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項目周期。

注2：在樣本量足夠的情況下，每個植物樣本最好準(zhǔn)備至少3個包埋塊，因植物組織目的結(jié)構(gòu)較薄，實驗建議進行全流程方案進行空間實驗，即一個包埋塊在一次切片實驗中完成結(jié)構(gòu)確認(rèn)，貼片表達，貼片透化，避免反復(fù)切片導(dǎo)致結(jié)構(gòu)損失，其余2塊用做備份，避免因樣本異常等特殊情況需要重新送樣而耽誤項目周期。

3.2 樣本采集與運輸

3.2.1 采集前準(zhǔn)備

1. 所有器械和環(huán)境需要消毒滅菌，所有器械（如剪刀、鑷子等）需要冰上預(yù)冷；
2. 在醫(yī)用托盤上放一層冰，然后覆蓋上一層錫箔紙，再鋪幾層無菌布，將個體放在無菌布上進行取樣，保持整個取樣過程在低溫中進行，可以延緩核酸的降解，（動物組織建議針對活體或剛死亡個體進行解剖取樣）；
3. 動物組織如果取樣后無法立即進行后續(xù)包埋實驗，可以將樣本清理干凈后，暫時放入組織保護液（美天旎，貨號130-100-008）或DPBS或生理鹽水中并置于4℃冰箱暫存，暫存時間最長不要超過5h，以免造成RNA降解，RIN值質(zhì)檢不合格；
4. 使用指定品牌的OCT（櫻花牌-4583）或OCT（leica-FSC 22）進行包埋，OCT使用前在冰上預(yù)冷30分鐘。

3.2.2 動物樣本采集

1. 取下新鮮組織，立即剔除結(jié)締組織和脂肪組織等非研究所需的組織類型，對腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)將周圍的腫瘤組織切除干凈）；
2. 迅速用預(yù)冷的 PBS溶液（RNase?free）或生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈，然后用無菌紗布吸凈表面液體；
3. 如果組織體積較大，需要將組織切成長寬＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng)S3000）的小塊，用7*7*5mm的特小號包埋盒進行包埋；取下的組織應(yīng)立即進行后續(xù)包埋實驗。

注：原則上實驗室不提供組織冷凍包埋相關(guān)試劑，需客戶網(wǎng)上自行購買，如有需要請聯(lián)系運營確認(rèn)實驗室是否有存貨，因 OCT 試劑無法分裝運送，實驗室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.3?植物樣本采集

1. 培養(yǎng)基培養(yǎng)樣本：在無菌超凈臺中取出組織，去除組織表面附著的培養(yǎng)基，用超純水將組織表面清洗干凈。從活體植株上取下新鮮目標(biāo)區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中，利用4℃預(yù)冷的鑷子和剪刀將目標(biāo)區(qū)域外的組織結(jié)構(gòu)盡量去除，若組織內(nèi)部存在空腔盡可能修剪組織暴露空腔，之后將組織裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng)S3000）的小塊；
2. 土壤培養(yǎng)樣本：將組織從培養(yǎng)土中完整取出，去除土壤及雜質(zhì)，用超純水將組織表面土壤及雜質(zhì)徹底清洗干凈。從活體植株上取下新鮮目標(biāo)區(qū)域組織置于培養(yǎng)皿中，利用4℃預(yù)冷的鑷子和剪刀將目標(biāo)區(qū)域外的組織結(jié)構(gòu)盡量去除，若組織內(nèi)部存在空腔盡可能修剪組織暴露空腔，之后將組織裁剪成＜5*6.5mm（10x Genomics）/6.8*6.8mm（百創(chuàng)S3000）的小塊；
3. 將目標(biāo)組織按照不同組織類型包埋方法進行包埋

注：原則上實驗室不提供組織冷凍包埋相關(guān)試劑，需客戶網(wǎng)上自行購買，如有需要請聯(lián)系運營確認(rèn)實驗室是否有存貨，因 OCT 試劑無法分裝運送，實驗室也僅僅可提供包埋盒。

3.2.4?動物組織速凍包埋

下文提供了2種包埋方法：干冰包埋法、異戊烷+液氮包埋法，客戶可根據(jù)實驗條件進行選擇。干冰包埋法適合更多的組織類型，是最常用的包埋方法，也可以得到較好的切片結(jié)果；異戊烷+液氮包埋法，可以快速降溫，保護細(xì)胞完整性，但操作較復(fù)雜，而且異戊烷對人體有一定的健康危害，一些較小、較輕的樣本如穿刺樣本推薦使用液氮+異戊烷的方法進行冷凍包埋。

方法1干冰包埋法（常用）

無需異戊烷，直接用干冰粒進行包埋。

1. 將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表面干燥；
2. 標(biāo)記包埋盒（樣本名稱、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對包埋盒做標(biāo)記，一旦冷凍包埋盒將很難標(biāo)記信息）；
3. 將包埋盒轉(zhuǎn)移到冰上，在包埋盒中注入預(yù)冷OCT，注入量為包埋盒高度的1/4-1/3，避免產(chǎn)生氣泡；
4. 冰上預(yù)冷鑷子，將組織放入OCT中，調(diào)整好方向，用OCT覆蓋任何裸露組織的表面，確認(rèn)沒有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除，以免影響組織切片形態(tài)結(jié)構(gòu)（此步需要拍照記錄，OCT冷凍后會變白，將很難確定組織的方向）；
5. 將包含組織和OCT的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會影響組織的方向，同時能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結(jié)變白（如下圖，右）。
6. 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標(biāo)記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運輸。

方法2?異戊烷+液氮包埋法

腦組織等容易形成冰晶或者水腫病變組織推薦使用此方案進行包埋。

1. 用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育15分鐘；
2. 將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表面干燥；
3. 標(biāo)記包埋盒（樣本名稱、樣本方向、包埋日期等，一定在冷凍之前，對包埋盒做標(biāo)記，一旦冷凍包埋盒將很難標(biāo)記信息）；
4. 將包埋盒轉(zhuǎn)移到冰上，在包埋盒中注入預(yù)冷OCT，注入量為包埋盒高度的1/4-1/3，避免產(chǎn)生氣泡；
5. 冰上預(yù)冷鑷子，將組織放入OCT中，調(diào)整好方向，用OCT覆蓋任何裸露組織的表面，確認(rèn)沒有氣泡，尤其是在組織附近，如果有氣泡可用移液槍將氣泡移除。以免影響組織切片形態(tài)結(jié)構(gòu)（此步需要拍照記錄，OCT冷凍后會變白，將很難確定組織的方向）；
6. 用鑷子將包埋盒放到異戊烷上，不要使異戊烷浸入包埋盒內(nèi)，直到組織凍結(jié)，冷凍時間可根據(jù)組織類型和大小而變化（如下圖）；
7. 將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標(biāo)記，直接保存在–80℃的密封容器中 ，利用干冰運輸。

3.2.5 植物組織速凍包埋

下文提供了 3 種包埋方法，根據(jù)植物組織的部位不同，我們推薦了不同的包埋方式：

方法一?：抽真空+干冰冷凍OCT包埋（不需要固定）

1）按照2.3植物采樣方法裁取樣本，空隙較多組織（花苞、莖尖）需將組織部分切開，目標(biāo)區(qū)域外組織需盡可能全部去除。

2）將植物組織浸泡在1ml 05%吐溫20中,室溫15min。

3）冰上預(yù)冷75% OCT包埋劑溶液（5mlOCT+2.5ml滅菌水顛倒混勻），1.5ml離心管中加入1ml 75%OCT，將植物組織浸潤在其中，將平底的無吸附膜的吸附柱放入1.5ml離心管中，以防止抽真空過程組織上浮在OCT表面，打開所有管蓋，置于真空濃縮儀中（注意配平）。室溫抽真空10min，摸索設(shè)置成V-AQ，促進OCT溶液充分包裹和進入組織空隙中，保證OCT填充包埋組織的完整性。如下圖：

4）將包埋盒放置在冰上 ，標(biāo)記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑，約1/4深度 ，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。

5）在冰上用鑷子輕輕夾住組織，輕輕擦拭表面的OCT，緩慢放入預(yù)冷的含OCT的包埋盒中 ，加預(yù)冷的OCT直至完全包裹組織，并調(diào)整組織在OCT中的位置 ，保證目標(biāo)平面與切面水平一致，如果多個組織包埋在一起時一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起，此過程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用200 μl槍頭吸出氣泡。

6）將包含組織和OCT的包埋盒放在干冰粒上輕輕按壓（如下圖，左），確保水平（否則會影響組織的方向，同時能保證干冰粒與包埋塊的接觸面積最大以達到快速降溫的效果），直到包埋塊完全凍結(jié)變白（如下圖，右）。

7）將 OCT 包埋的組織塊和包埋盒用錫紙包裹好，做好樣本標(biāo)記，直接保存在–80℃的密封容器中，利用干冰運輸。

方法二?：直接冷凍OCT包埋（無需抽真空）

1. 按照2.3植物采樣方法裁取樣本
2. 將植物組織浸泡在1ml 05%吐溫20中,室溫15min。
3. 將包埋盒放置在冰上 ，標(biāo)記包埋盒（組織放置的方向 、樣品名稱等）（可拍照記錄），在包埋盒底部加入適量的OCT包埋劑，約1/4深度 ，防止組織沉底直接接觸包埋盒底部 。
4. 在冰上用鑷子輕輕夾住組織 ，緩慢放入預(yù)冷的OCT包埋劑中 ，直至OCT完全包裹組織。
5. 調(diào)整組織在OCT中的位置，盡量將組織放置于包埋盒的中部，保證目標(biāo)平面與切面水平一致。如果多個組織包埋在一起時一定要將組織放置于包埋盒的中部排列整齊 ，避免重疊在一起 ， 此過程中避免產(chǎn)生氣泡，如有氣泡產(chǎn)生用用針尖輕緩挑出氣泡或用200 μl槍頭吸出氣泡。
6. 用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中 （液氮與異戊烷保持相同的水平面）以充分接觸，孵育5- 10分鐘，時間不宜太久，防止異戊烷凝結(jié) 。（若無異戊烷及液氮可使用干冰包埋）
7. 用鑷子夾住包埋盒置于預(yù)冷的液氮-異戊烷浴上（避免模具被異戊烷浸沒）或干冰上，然后等待OCT凝固變白。
8. 將 OCT 包埋的組織塊或者包埋盒用錫紙包裹好，直接保存在–80℃的密封容器中 ，做好樣本標(biāo)記，利用干冰運輸。

方法三?：石蠟包埋

石蠟包埋請使用百邁客專用試劑盒(試用裝)，此試劑盒適用于主根、莖、幼果（含水量大）等組織類型，OCT切片破碎的組織也可以使用此試劑盒嘗試包埋切片。

詳細(xì)操作步驟請查看試劑盒說明書（此試劑盒目前為試用裝，未正式發(fā)布，有需求可溝通銷售）

3.2.6?樣本寄送運輸

包埋后的組織用錫箔紙包住，放入密封袋中密封，放入樣本盒在液氮或者-80℃冰箱長期保存，或者放置在干冰上進行冷凍運輸，寄送到百邁客實驗室，干冰寄送推薦用量約5kg/日。

不規(guī)范送樣示例：

A.包埋時組織放置靠近最下層，組織未被OCT包裹，導(dǎo)致樣本RNA降解，質(zhì)檢不合格；

B.組織暴露在空氣中，導(dǎo)致樣本降解，組織兩側(cè)無OCT支撐，展片時可能會破壞樣本結(jié)構(gòu)；

C.組織較小，不滿足做表達最小25%的要求；

D.同一個包埋塊包埋了多個樣本，但不在同一個平面，并且每一個樣本組織過小，覆蓋區(qū)域有限，可能導(dǎo)致分析有效數(shù)據(jù)偏低。

3.3?切片質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

• 組織形態(tài)學(xué)檢測：對動物組織切片進行H&E染色，對植物組織切片進行甲苯胺藍(lán)染色，觀察是否獲取到目標(biāo)區(qū)域，組織形態(tài)完整性是否在可接受范圍內(nèi)（例如是否有大的裂痕，存在明顯的空泡、褶皺等）。
• RNA完整性檢測：收取10-15張切片，利用Agilent2100對樣本進行RNA完整性檢測，要求RNARIN≥6，則認(rèn)為樣本完整性滿足實驗要求，可以進行后續(xù)實驗。具體切片質(zhì)檢量如下：

1）10微米切片厚度，組織占包埋塊面積的1/5-1/4，質(zhì)檢量要求~20張（左圖）；

2）10微米切片厚度，組織占包埋塊面積的＞1/3，質(zhì)檢量要求~15張（右圖）。

3.4 測序數(shù)據(jù)量推薦

測序數(shù)據(jù)量：10x Genomics推薦60G/樣，百創(chuàng)S3000推薦250G/樣；

測序平臺：SURFSeq?5000

研究背景

大白菜是一種重要的結(jié)葉蔬菜作物。在抽穗期，葉片內(nèi)外表現(xiàn)出明顯的形態(tài)分化。然而，這種復(fù)雜的葉片形態(tài)分化的遺傳控制仍不清楚。

研究目的

在此，作者研究了抽穗期連續(xù)的頭葉從內(nèi)到外的轉(zhuǎn)錄組譜，通過在24個不同的葉片組織中展示了全基因組基因表達的序列-空間剖面，確定了可能在葉片抽穗中發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵過渡頭葉片，為葉狀頭部的形成提供新見解。

材料方法

在溫室盆栽大白菜，使用11周大的植物進行取樣。隨機選擇兩個正常生長的大白菜。從外葉到內(nèi)葉的所有頭葉（葉長>2cm）按順序分離收集，而帶有莖尖分生組織(SAM）的幼葉和小內(nèi)葉（葉長<2cm）不分離，按順序收集。從每個大白菜頭部共得到30片葉子。從內(nèi)到外，每3片形態(tài)相似、大小相近的葉子為一葉輪，共得到10葉輪葉。

從每輪葉片中選取一片葉子，命名為L1-L10，選擇SAM、L1、L2、L3、L5、L7和L9進行轉(zhuǎn)錄組分析。對于RNA-seq，L2被分為兩部分，葉柄(L2R2）和葉片(L2R1），對于L3、L5、L7和L9，則分為五個區(qū)域，包括頂部(R1）、外緣(R2）、葉片的中部區(qū)域(R3）、葉柄的頂部(R4）和中部(R5）區(qū)域進行采樣。對來自兩個生物學(xué)重復(fù)（兩個葉頭）共計48個樣品用Illumina平臺進行轉(zhuǎn)錄組測序。

圖1. 跨越11個葉子層的葉子的代表性圖片

研究結(jié)果

1、轉(zhuǎn)錄組測序

對48個樣本進行轉(zhuǎn)錄組測序，共產(chǎn)生7.43×108高質(zhì)量cleanreads，皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.92-0.99，所有生物學(xué)重復(fù)都高度相關(guān)。將cleanread與大白菜參考基因組進行比對，計算基因表達量TPM值，共鑒定出27,876個基因。其中，75.08%的基因在所有樣品中都有表達。

主成分分析(PCA）顯示沿主成分(PC）1和2有明顯的分離。PC1根據(jù)與SAM的距離將葉片樣本分開，而PC2將葉片和葉柄組織分開。層次聚類分析將樣本分為五類，與葉子形態(tài)分化一致。SAM和L1的樣本形成內(nèi)葉1(IL1）最接近莖尖的組織。內(nèi)葉2的葉片（IL2B）和內(nèi)葉2的葉柄（IL2P）代表L2-L5的葉片和葉柄組織，而外葉（OLB）和外葉柄（OLP）代表L2-L5的葉片和葉柄組織外葉（L7和L9），與葉子形態(tài)分化一致。

圖2. 抽穗期不同葉層大白菜葉片的轉(zhuǎn)錄組分析

2、差異表達基因分析

作者在全基因組水平上鑒定了不同葉片中的差異表達基因（DEG），以探索葉片之間的多樣性和潛在功能。通過分析，共發(fā)現(xiàn)9,133DEG，k-means聚類將差異基因分為14個共表達簇(CEC1-CEC14），這些CEC與圖1中的5個聚類簇緊密相關(guān)。IL1中DEGs的高表達水平以CEC1和2為代表。CEC1在SAM中高度表達，并以與分生組織發(fā)育、組織發(fā)育和近軸/遠(yuǎn)軸極性相關(guān)的基因為代表。CEC2在SAM和L1高表達，包含與細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖、細(xì)胞生長和生長素生物合成過程相關(guān)的基因。IL2B中DEG的高表達水平以CEC4-6為代表。CEC4、5和6均富集于有機酸代謝過程、淀粉代謝過程、質(zhì)體組織和硫苷代謝、光合光反應(yīng)等過程。IL2P中DEGs的高表達以CEC9為代表。CEC9富含植物細(xì)胞壁相關(guān)過程，包括壁組織或生物發(fā)生，以及果膠代謝過程。OLB中DEGs以CEC7和8為代表。CEC7在L7葉片中高表達，并以與蛋白質(zhì)修飾過程、蛋白質(zhì)磷酸化和蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性相關(guān)的基因為代表。這些結(jié)果反映L7具有明顯的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控特征。CEC8在L9葉片中高表達，含有一組與葉綠素分解代謝過程、細(xì)胞分解代謝過程、防御反應(yīng)調(diào)節(jié)、果糖反應(yīng)和脫落酸激活信號通路相關(guān)的基因。OLP中DEG的高表達水平以CEC11和12為代表。CEC11中的基因在L7-L9的葉柄中高度表達，在任何基因本體(GO）術(shù)語中均未富集。CEC12中的基因在L9的葉柄中高度表達。這些基因可能主要參與脫落酸激活的信號通路、茉莉酸（JA）代謝過程、JA反應(yīng)、防御反應(yīng)、生物刺激反應(yīng)、水楊酸反應(yīng)和外部刺激反應(yīng)。這些結(jié)果表明，L9可能在保護多葉頭部免受外部損害方面發(fā)揮作用。

圖3.差異基因在不同葉子中的表達譜

3、葉片發(fā)育相關(guān)基因的表達揭示葉球形成中的關(guān)鍵過渡葉

作者鑒定了細(xì)胞增殖相關(guān)基因和細(xì)胞擴張相關(guān)基因。結(jié)果表明，大多數(shù)細(xì)胞增殖基因在IL1HLs中達到峰值，包括SAM和L1，但在IL2HLs和外HLs中迅速下調(diào)(圖3A），表明細(xì)胞增殖基因在不斷生長的內(nèi)葉的起始過程中發(fā)揮重要作用。與細(xì)胞增殖基因不同，大部分細(xì)胞擴張基因在IL2HLs和外HLs的葉片區(qū)域高表達，且表達模式更為多樣，分為4個簇(圖3A）。此外，大部分細(xì)胞擴張基因在IL2HLs和外層HLs之間表現(xiàn)出不同的表達模式，導(dǎo)致L7細(xì)胞分裂和細(xì)胞擴張調(diào)控的變化明顯高于IL2HLs和外層葉(圖3B）。

圖4. 細(xì)胞增殖和細(xì)胞擴增基因的表達模式

大白菜HLs的彎曲通常被認(rèn)為是由葉片正軸和背軸之間的不對稱細(xì)胞生長引起的。通過分析ad-ab極性基因的表達模式，以探究ad-ab極性基因在頭葉曲率中的作用。結(jié)果表明，與內(nèi)部HL相比，大多數(shù)ad-ab極性基因在外部HL中顯示出顯著不同的表達模式。

圖5.?ad-ab極性基因的表達譜。

通過形態(tài)學(xué)觀察、PCA和聚類分析，以及與細(xì)胞分裂/擴張和ad-ab極性相關(guān)的基因表達，L7位于內(nèi)葉和外葉之間的邊界。作者通過主成分分析和聚類將L7分類為外葉組，最終確定L7是顯示三種模式的過渡狀態(tài)。此外，作者進一步分析了HLs中可溶性糖的積累和相關(guān)基因的表達特征，進一步證實L7是葉狀頭部發(fā)育的關(guān)鍵過渡葉。

4、加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析

為確定導(dǎo)致過渡葉特殊狀態(tài)的形成過程，作者進行加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）。WGCNA共確定了17個模塊。其中，五個模塊（greenyellow、magenta、purple、turquoise和yellow）與過渡葉密切關(guān)聯(lián)。兩個模塊，greenyellow和magenta，與過渡葉特別相關(guān)，并包含許多編碼蛋白激酶的基因，包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK）、鈣依賴性蛋白激酶(CDPK）和富含半胱氨酸的受體樣激酶。關(guān)鍵過渡葉片L7可能受到復(fù)雜信號相互作用的調(diào)節(jié)，不僅是光和其他外部刺激，也有內(nèi)部激素。

文章亮點

作者報道了大白菜抽穗期的轉(zhuǎn)錄組圖譜，利用24個空間解剖組織，分別代表大白菜內(nèi)外葉的不同區(qū)域。全基因組轉(zhuǎn)錄組分析清楚地將內(nèi)葉組織與外葉組織分離開來。通過對葉片發(fā)育和糖代謝關(guān)鍵基因的空間表達分析，確定了關(guān)鍵過渡葉，關(guān)鍵過渡葉是第一批內(nèi)彎的葉片。關(guān)鍵過渡葉的形成由一個復(fù)雜的信號網(wǎng)絡(luò)控制，不僅包括內(nèi)部激素和蛋白激酶，還包括外部光和其他刺激。這個發(fā)現(xiàn)為揭示抽穗性狀的遺傳控制提供了新的見解和豐富的資源。研究過程中作者利用生活中常見材料，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組進行分析，思路簡單，設(shè)計巧妙，值得借鑒學(xué)習(xí)。

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2022年值得關(guān)注的7大技術(shù)榜單

2021年利用空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)文章呈現(xiàn)井噴式增長，其中已正式發(fā)表文章有40余篇，而空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)為特色的預(yù)印本bioRxiv搜索“空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（spatial transcriptomics）”一詞，獲得了500余條結(jié)果，其中80余條是在2021年提交的，可以說2021年是空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)應(yīng)用好文發(fā)表突飛猛進的一年。

2016年-2021年空間轉(zhuǎn)錄組文章發(fā)表趨勢和影響因子分布

通過檢索空間轉(zhuǎn)錄組發(fā)表文章的數(shù)據(jù)分析來看，該技術(shù)在2021年中得到廣泛應(yīng)用，并且文章影響因子主要集中在10~20分區(qū)間，其占比高達39%，其次在30分以上占比達到30%，由此可見空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的應(yīng)用極大提升了文章的質(zhì)量和檔次。

不僅如此，2021年空間轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)還在物種上有了新的突破，不再局限于人和鼠常見的模式物種，已經(jīng)開始邁入哺乳動物（豬）、家禽類（雞）、植物類（擬南芥、云杉、楊樹）等新的物種領(lǐng)域，極大拓展其應(yīng)用范圍。

物種空間轉(zhuǎn)錄組文獻發(fā)表統(tǒng)計

2021年空間轉(zhuǎn)錄組在不同組織部位上應(yīng)用也取得一些新進展：比如骨組織一類就有不少文章發(fā)表，有頭蓋骨[PNAS，IF=11.2]、腰骨骼肌[NatureCommunications，IF=14.9]、肩部肌腱[AnnRheum Dis，IF=19.1 ]；生殖器官有子宮內(nèi)膜[Nat Genet，IF=27.6]、卵巢[NatureBiotechnology，IF=54.9]；泌尿系統(tǒng)：前列腺[Nature Communications，IF=14.9]、膀胱[NatureCommunications，IF=14.9]；腸道組織：胎兒腸道[Cell，IF=41.6]；脂肪組織：皮下腹部[CellMetabolism，IF=27.3]；腦組織：腦內(nèi)炎癥[[Ann Rheum Dis，IF=19.1 ]，IF=24.9]、等皮質(zhì)和海馬[Cell，IF=41.6]、腦神經(jīng)系統(tǒng)[AnnuRev Neurosci，IF=12.4]、前額葉皮層[Nat Neurosci，IF=24.9]、海馬和前額葉皮質(zhì)[NatureCommunications，IF=14.9]等都組織區(qū)域都有不錯的研究報道，甚至連取材最困難的皮膚樣本都發(fā)表重要研究成果：皮膚肉芽腫[Nature Immunology ，IF=25.6]，空間轉(zhuǎn)錄組逐漸在更多的組織類型上得到廣泛的應(yīng)用，揭示更深層次空間維度生物學(xué)表型。

空間轉(zhuǎn)錄組不同組織應(yīng)用發(fā)表文獻統(tǒng)計

基于上面數(shù)據(jù)我們不難看出來前期研究，腦組織空間基因表達探索最為廣泛，當(dāng)然還有心臟組織、肝組織前列腺組織；植物主要集中在花序器官的研究，隨著各種組織探索和嘗試，基本上空間轉(zhuǎn)錄組已經(jīng)在各種組織中全面開火，不管從技術(shù)的前瞻性也好，還是從空間這個維度深度闡釋一些生物學(xué)現(xiàn)象，彌補了細(xì)胞空間位置信息的趨勢，空間多組學(xué)技術(shù)毫無疑問成為引領(lǐng)科學(xué)研究的風(fēng)向標(biāo)。

后續(xù)文章，敬請關(guān)注：

2021年度空間轉(zhuǎn)錄組動植物四大應(yīng)用方向：時空圖譜篇（發(fā)育）、腫瘤篇、疾病機制篇、生物進化篇

關(guān)注我們

大腦是一個具有精密組織結(jié)構(gòu)的重要器官。對于大腦結(jié)構(gòu)-功能的關(guān)系、發(fā)育過程中大腦皮層以及退行性神經(jīng)疾病領(lǐng)域的研究，空間轉(zhuǎn)錄組可以揭示更多的信息。單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組結(jié)合可以將關(guān)注的細(xì)胞類型及亞型√確的錨定到空間位置上，解析不同功能區(qū)域與細(xì)胞類型及亞型的關(guān)聯(lián)性。

文獻一

英文題目：Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the?mouse brain

中文題目：小鼠大腦神經(jīng)炎性星形細(xì)胞亞型

期刊：nature neuroscience

IF：24.884

文獻鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34413515

實驗材料：脂多糖（LPS）和生理鹽水（saline）處理的雄性和雌性小鼠進行scRNA-seq，共捕獲79944個星形膠質(zhì)細(xì)胞。3個LPS和saline小鼠大腦組織切片進行空間轉(zhuǎn)錄組。

研究背景：星形膠質(zhì)細(xì)胞在感染、急性損傷和慢性神經(jīng)退行性疾病后發(fā)生炎癥轉(zhuǎn)變。這種轉(zhuǎn)變是如何受到時間和性別的影響，它在單細(xì)胞水平上的異質(zhì)性，以及亞狀態(tài)在大腦中的空間位置上如何分布，目前仍不清楚。

研究結(jié)論：在本研究中作者使用細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)毒素脂多糖研究小鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞在急性炎癥刺激后的轉(zhuǎn)錄組變化。發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組變化發(fā)生在數(shù)小時內(nèi)，隨著時間的推移急劇變化。通過對約80000個星形膠質(zhì)細(xì)胞進行單細(xì)胞測序，發(fā)現(xiàn)炎癥引起廣譜的反應(yīng)，亞型星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)歷了不同的炎癥轉(zhuǎn)變，并具有明確的轉(zhuǎn)錄組特征。利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和原位雜交技術(shù)將炎癥誘導(dǎo)的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵亞狀態(tài)錨定大腦區(qū)域?？傊?，數(shù)據(jù)集為分析星形膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性提供了強大的資源，并將有助于理解局部受限反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞亞狀態(tài)的生物學(xué)重要性。

圖1 DLPFC組織空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)

文獻二

英文題目：Neuroinflammatory astrocyte subtypes in the?mouse brain

中文題目：小鼠大腦神經(jīng)炎性星形細(xì)胞亞型

期刊：nature neuroscience

IF：24.884

文獻鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34413515

實驗材料：脂多糖（LPS）和生理鹽水（saline）處理的雄性和雌性小鼠進行scRNA-seq，共捕獲79944個星形膠質(zhì)細(xì)胞。3個LPS和saline小鼠大腦組織切片進行空間轉(zhuǎn)錄組。

研究背景：星形膠質(zhì)細(xì)胞在感染、急性損傷和慢性神經(jīng)退行性疾病后發(fā)生炎癥轉(zhuǎn)變。這種轉(zhuǎn)變是如何受到時間和性別的影響，它在單細(xì)胞水平上的異質(zhì)性，以及亞狀態(tài)在大腦中的空間位置上如何分布，目前仍不清楚。

研究結(jié)論：在本研究中作者使用細(xì)菌細(xì)胞壁內(nèi)毒素脂多糖研究小鼠皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞在急性炎癥刺激后的轉(zhuǎn)錄組變化。發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組變化發(fā)生在數(shù)小時內(nèi)，隨著時間的推移急劇變化。通過對約80000個星形膠質(zhì)細(xì)胞進行單細(xì)胞測序，發(fā)現(xiàn)炎癥引起廣譜的反應(yīng)，亞型星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)歷了不同的炎癥轉(zhuǎn)變，并具有明確的轉(zhuǎn)錄組特征。利用轉(zhuǎn)空間錄組學(xué)和原位雜交技術(shù)將炎癥誘導(dǎo)的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的關(guān)鍵亞狀態(tài)錨定大腦區(qū)域?？傊?，數(shù)據(jù)集為分析星形膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性提供了強大的資源，并將有助于理解局部受限反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞亞狀態(tài)的生物學(xué)重要性。

圖2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組鑒定星形細(xì)胞亞群及空間轉(zhuǎn)錄組細(xì)胞定位

文獻三

英文題目：Molecular atlas of the adult mouse brain

中文題目：成年小鼠腦分子圖片

期刊：Science advances

IF：13.116

文獻鏈接：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/32637622

實驗材料：三只雄性小鼠（9周齡）的大腦

研究背景：在建立子區(qū)域及其邊界的參考圖以及確定神經(jīng)元類型及其連接性的多樣性方面，對成年大腦進行映射是探索定義動物行為多樣性的腦回路的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的核心。實驗神經(jīng)科學(xué)依賴于重復(fù)準(zhǔn)確地記錄和操縱特定大腦區(qū)域中神經(jīng)元亞型活動的能力，因此，基因靶向方法已被證明在針對細(xì)胞類型的靶向中極為有價值。

研究結(jié)論：作者基于全腦范圍內(nèi)ST模式的無監(jiān)督分類建立了成年小鼠大腦的分子圖譜。這種方法是一個在全腦范圍內(nèi)映射離散空間域的無偏方法，并且還利用空間信息開發(fā)分子方法以研究神經(jīng)系統(tǒng)組織，引入了分子和空間代碼進化保守性的能力，以及它們與生理學(xué)和病理學(xué)的關(guān)系。另外作者簡化了大腦基因索引測試區(qū)域分類的能力，這些基因也足以將整個成年大腦映射到相關(guān)的子區(qū)域。這種方法從分子視角對全腦進行分類繪制圖譜，并比較物種間腦區(qū)域分布的保守分子標(biāo)記，可作為關(guān)鍵點為治療腦部疾病提供新策略。

圖3 空間轉(zhuǎn)錄組繪制全腦分子圖譜

空間轉(zhuǎn)錄組在神經(jīng)學(xué)方向研究思路

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